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來氟米特對體外培養的大鼠樹突狀細胞成熟過程

來源:未知 2019-07-23 09:54

摘要:

  目的:研究來氟米特對體外培養的大鼠樹突狀細胞(DC)成熟過程的影響,探討來氟米特處理的DC延長同種移植物存活時間和誘導對供者抗原特異性免疫耐受的機理。方法:將體外培養的大

  來氟米特對體外培養的大鼠樹突狀細胞成熟過程及其同種免疫刺激活性的影響

  董大海 駱磊 宋金蕾 張桂銘 李斌 馬曉誠 孫立江

(青島大學附屬醫院泌尿外科,山東省青島市 266003)

  

       摘要:目的:研究來氟米特對體外培養的大鼠樹突狀細胞(DC)成熟過程的影響,探討來氟米特處理的DC延長同種移植物存活時間和誘導對供者抗原特異性免疫耐受的機理。方法:將體外培養的大鼠DC分為四組,分別為對照組、來氟米特處理組、脂多糖(LPS)刺激組、LPS+來氟米特聯合處理組。用流式細胞儀對各組細胞進行免疫表型分析,ELISA方法分別檢測其IL-12的分泌,并作混合淋巴細胞培養以觀察其對同種T細胞的刺激能力。

  關鍵詞:來氟米特;樹突狀細胞;免疫耐受

  

  結果:來氟米特顯著抑制了外源刺激下DC的成熟過程,抑制其表面共刺激分子的表達,降低IL-12的分泌,并顯著抑制其同種T細胞的激活能力。

  結論:來氟米特通過抑制DC的成熟過程,延長同種移植物存活時間和誘導對供者抗原特異性免疫耐受。

  樹突狀細胞(Dendritic cell,DC)作為體內最重要的抗原呈遞細胞,在調整移植免疫反應中起雙重作用。一方面,作為過客白細胞,從移植的器官中游走至受體,激活受體特異的naive T細胞,從而觸發排斥反應;另一方面,DC也能夠調節T細胞反應,產生外周免疫耐受。目前認為,在移植的受體內,不成熟的DC從外周組織或血液中游走至其所引流淋巴器官時,可以誘導抗原特異性T細胞無反應,而產生免疫耐受。Demetris[1]的研究表明,供者來源DC的長期存活對維持長期的移植耐受和防止移植物慢性排斥十分重要。來氟米特作為常用的免疫抑制劑,通過多種途徑發揮免疫抑制作用。但其對樹突狀細胞的作用目前研究還處于初步階段。為了解來氟米特處理后的DC表面共刺激分子的表達情況及在免疫耐受中的作用機制,我們做了如下實驗研究。

  1 材料與方法 Materials and methods

  設計:細胞形態學觀察實驗

  時間及地點:于2013年-2014年在青島大學附屬醫院中心實驗室完成

  材料:雄性Wister大鼠,由青島大學附屬醫院動物實驗中心提供;雄性SD大鼠,由上海斯萊克實驗動物有限公司提供;周齡為8-12周,每只體重200-250g。

  試劑與儀器:重組大鼠粒-單細胞集落刺激因子(GM-CSF)、重組大鼠白細胞介素-4(IL-4)均購自美國Sigma公司;藻紅蛋白(PE)標記的抗大鼠CD80、異硫氰基熒光素(FITC)標記的抗大鼠CD86、,同型對照抗大鼠IgG均購自美國BD公司;脂多糖(LPS)購自青島博賽科貿有限公司,流式細胞儀購自美國Coulter公司 。

  實驗方法:

  未成熟樹突狀細胞(imDC)的制備: 參考Inaba[2]的方法并稍作改進:完整取出Wister大鼠股骨和脛骨,用RPMI 1640培養液沖洗出骨髓細胞,用F-H離心出界面細胞,加入RPMI 1640混勻,調整細胞濃度為2×106/ml,置入24孔板,每孔1ml;每孔加入GM-CSF至調整濃度1.5ng/ml,IL-4 4ng/ml;于37℃、5%CO2條件下培養,每培養2天,吸去75%培養液,重新加入新培養液;第7天左右收獲貼壁細胞,即為未成熟樹突狀細胞。

  試驗分組:本實驗共分四組,每組5只大鼠,分別是對照組、來氟米特處理組、脂多糖(LPS)刺激組、LPS+來氟米特聯合處理組。對照組只加培養液;來氟米特處理組自骨髓細胞培養開始每孔加入來氟米特 10ng/ml,換液時加入同樣劑量的來氟米特;LPS刺激組在細胞培養結束前18h加入外源性的LPS100ng/ml刺激;聯合處理組分別按上述要求加入來氟米特和LPS。

  細胞形態學觀察、免疫表型分析(FCM)及培養液中IL-12水平的測定:分別收集各組不同培養條件下的DC,將它們等量分裝于流式細胞儀專用離心管,調整細胞濃度為 5×106/ml,于 100μl 細胞懸液中分別加入 PE 或 FITC標記的抗大鼠 CD80、CD86單克隆抗體 1μl,同時設PE 或FITC標記的正常大鼠 IgG抗體做陰性對照,用流式細胞儀進行表型分析。并分別收集培養液上清100μl,用IL-12的ELISA試劑盒按說明書進行IL-12水平測定。

  混合淋巴細胞反應(MLR):取培養7天的Wister大鼠imDC 懸液,調整濃度為1×106/ml,加入絲裂霉素C ,使其最終濃度為25ng/ml,于37℃水浴孵育30min,1000r/min離心10min,棄上清液,沉淀細胞用Hanks液洗滌3次,調整濃度為2×106/ml,此作為刺激細胞;制備SD大鼠脾細胞懸液,經淋巴細胞分離液分離出單個核細胞,置于玻璃平皿中,于37℃溫箱靜置30min,用毛細吸管吸取未黏附的細胞懸液,并調整淋巴細胞懸液濃度為2×106/ml,此作為反應細胞;取兩細胞各0.2ml于培養板,加入1.8ml含20%胎牛血清的RPMI1640培養液,置37℃,5% C02培養箱培養6d。終止培養前4h,加MTT至培養板,20ul/孔。終止培養后,吸棄培養液,每孔加入DMSO150μl,充分混勻后靜置數分鐘。置酶標儀,測490 nm A值。刺激指數(SI)=試驗孔放射性熒光閃爍計數值OD值/對照孔OD值。

  統計學分析 用方差分析檢驗各組均數間的差異顯著性,P<0.05為差異有統計學意義,P<0.01為差異有顯著統計學意義。采用S-N-K檢驗進一步分析組間差異。

  2 結果 Results

  2.1來氟米特抑制DC表面共刺激分子的表達

  對照組imDC表面CD80、CD86表達陽性率分別為19.3%、37.4%,均為低表達(圖1、圖2);LPS刺激組DC表面CD80、CD86表達陽性率分別為58.6%、69.2%(圖3、圖4);來氟米特處理組DC表面CD80、CD86表達陽性率分別為12.9%、21.5%(圖5、圖6);LPS+來氟米特處理組DC表面CD80、CD86表達陽性率分別為37.0%、39.4%(圖7、圖8)。以上結果說明,18h LPS刺激顯著促進了DC表面共刺激分子的表達水平和功能成熟,但是LPS卻不能成功地提高經來氟米特處理的DC表面的CD80和CD86的表達量。因此,來氟米特能夠抑制DC表面CD80和CD86分子的上調,對DC的功能成熟具有明顯的抑制作用。

  圖1   對照組CD80表達

  圖2   對照組CD86表達

  圖3   LPS刺激組CD80表達

  圖4   LPS刺激組CD86表達

  圖5   來氟米特處理組CD80表達

  圖6   來氟米特處理組CD86表達

 

  圖7   LPS+來氟米特處理組CD80表達

  圖8  LPS+來氟米特處理組CD86表達

  2.2 來氟米特抑制DC分泌IL-12的分析結果

  按照IL-12的ELISA試劑盒說明書進行實驗,我們檢測各組培養第7天的DC培養上清液中的IL-12水平。結果顯示,來氟米特處理組與對照組之間IL-12量差異有高度統計學意義(P<0.01);LPS的刺激能顯著提高IL-12的分泌,與對照組之間差異有高度統計學意義(P<0.01);在LPS刺激條件下,來氟米特有助于抑制DC大量分泌IL-12,后兩組之間差異有高度統計學意義(P<0.01)(見表1)。

  2.3 來氟米特處理的DC同種刺激活性結果

  方差分析結果顯示,各組SI值差異有高度統計學意義(P<0.01);進一步S-N-K檢驗示對照組與LPS+來氟米特組之間差異不顯著,其他各組間差異均有統計學意義(P<0.05)。(見表1)

  表1 各組DC培養上清液中IL-12濃度測定值及MLR結果

組別

例數

IL-12濃度(pg/ml)

SI值

對照組

5

115.20±15.97

2.13±0.47

來氟米特處理組

5

56.20±7.05

1.09±0.32

LPS刺激組

5

828.80±41.93

5.86±0.54

LPS+來氟米特組

5

320.40±39.09

3.08±0.85

  3.討論

  隨著移植技術及術后管理的日漸成熟,器官移植已廣泛應用于治療各種終末期疾病并取得了劃時代的進步。但器官移植后產生的排斥反應仍是嚴重阻礙器官移植向前發展的絆腳石,是器官移植中長期存在且尚未克服的醫學難題。目前應用于臨床的免疫抑制劑雖能使移植排斥反應得到有效控制,但由于其對受者免疫系統非選擇性的廣泛抑制,常引起感染、腫瘤等諸多并發癥。因此,誘導對供者特異性免疫耐受被認為是最終克服移植后排斥的有效途徑。DC作為體內專職的抗原呈遞細胞,在決定耐受或免疫方面起關鍵作用。目前發現,未成熟DC(imDC)往往能夠促進免疫反應向耐受方向發展,而成熟DC更容易誘發排斥反應的發生[3]。DC的表面標志很多,不同發育階段的DC,其表面標志不盡相同。一般認為imDC表達低水平的MHC-Ⅱ類分子、共刺激分子(CD80和CD86)、黏附分子(CD40和CD44)等;而成熟DC高表達MHC-I、MHC-Ⅱ類分子以及CD80、CD86、CD40等共刺激分子,誘導CD4+和CD8+ T細胞活化增殖,誘發免疫應答[4、5]。imDC表面由于不表達或低表達共刺激分子及黏附分子,不能有效激活幼稚T細胞,通過T細胞凋亡、無能或低反應等多種機制誘導免疫耐受的形成[4、5]。

  1992年Inaba[2]等首次報道用GM-CSF從正常小鼠骨髓和血液中制備出DC祖細胞。此后幾個實驗先后報道了用GM-CSF培養高刺激活性或耐受原性的人、靈長類、大鼠或小鼠DC的方法。Lutz[6]等證實:在應用小劑量的GM-CSF(50U/ml)的條件下,體外培養的骨髓DC可以不被LPS、TNF-α誘導成熟,而在體內無免疫抑制劑的條件下,可以延長移植心臟存活時間。Fu等[7]以重組 GM-CSF培育小鼠骨髓細胞得到imDC,將其在移植術前7天輸入同種鼠體內,結果使同種移植物存活時間明顯延長;對受體鼠脾臟進行雙標記免疫組化染色證明,供者imDC進入受體鼠7天后,其表面CD80和CD86的表達均明顯增加。由此可以證明,在受者體內復雜的免疫系統中,DC的迅速成熟是其不能夠誘導長期穩定的抗原特異性免疫耐受的原因。我們的實驗中在imDC中加入LPS以模擬體內刺激DC成熟的細胞因子環境。實驗結果表明在LPS的刺激下, DC表面的共刺激分子的表達迅速提高,IL-12大量分泌,同時提高了DC刺激同種T細胞的能力。

  來氟米特是人工合成的異惡唑類藥物,其主要作用機制包括抑制核苷酸代謝、抑制NF-kB、抑制蛋白酪氨酸激酶活性、調節Th淋巴細胞亞群分化。動物實驗證實它可以有效地預防、治療腎移植術后急性排斥反應,其作用機制是抑制二氫乳酸脫氫酶。其對T淋巴細胞和B淋巴細胞都有抑制作用,可以抑制細胞性和體液性急性排斥反應。術后早期用來氟米特或小劑量與環孢素聯合使用,可以緩解甚至部分逆轉慢性排斥反應的發生,使移植器官的血管壁增厚、間質纖維化等得到不同程度的改善。來氟米特一方面與其他細胞毒藥物(嗎替麥考酚酯、硫唑嘌呤等)一樣可以抑制淋巴細胞代謝,同時又可抑制細胞內信號轉導的多個環節,與鈣調神經阻滯劑有協同作用。因此,為多種免疫抑制劑聯合方案提供了新的選擇[8]。

  目前,低表達共刺激分子CD80/CD86的未成熟樹突細胞能誘導免疫耐受已得到廣泛證實。姜曉峰等[9]阻斷CD40-CD40配體共刺激信號可以誘導出免疫耐受狀態,而CD40-CD40配體共刺激信號通過影響樹突狀細胞起作用。郝念等[10]證實來氟米特能抑制大鼠DC 分化成熟,可能通過抑制樹突狀細胞分化成熟誘導受體對角膜植片形成免疫耐受;李偉等[11]采用來氟米特治療活動性強直性脊柱炎,治療后患者血清中IL-12水平均明顯降低,其機制可能是通過抑制機體免疫系統,減少炎性細胞因子(如IL-12)的產生,從而阻止或減緩強直性脊柱炎患者脊柱關節病損的發展。我們的實驗證實在DC培養液中加入來氟米特,可使DC表面共刺激分子如CD80和CD86表達量更低,分泌的IL-12更少,抑制了DC的成熟過程,同上述文獻結果一致。在外源性因素LPS的刺激下,來氟米特仍能使DC表面CD80和CD86低表達,說明來氟米特使DC具備了對外界刺激的抵抗性。進一步的MLR結果表明,其對同種T細胞的刺激能力更弱,因此更有利于誘導Th2型免疫應答和產生同種抗原特異性的T細胞無能,從而表明了來氟米特處理的DC延長同種移植物存活和誘導對供者抗原特異性免疫耐受的分子基礎。

  參考文獻

  [1]Demetris AJ,Murase N,Fujisaki S,et al.Hematolymphoid cell traffic- king,microchimerism,and GVHD reactions after liver,bone marrow,and heart transplantation[J]. Transplant Proc, 1993,25:33

  37

  [2] Inaba K,Inaba M,Romani N,et al.Generation of large numbers of dendrit- ic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte /macrophage colony-stimulating factor [J].Exp Med,1992,176:1693

  [3]Morelli AE,Cownell PJ,Khanna A,et al.Preferential induction of Th1 responses by functionally mature hepatic dendritic cells:Association with conversion from liver transplant tolerance to acute rejection [J].Transplantation,2000,69(12):2647

  [4]Sallusto F, Cella M, Danieli C,et al.Dentritic cells use macropino- cytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocompat- ibility complex class II compar- -tment: downregulation by cytokines and bacterial products[J]. ExpMed,1995,182:389

  [5]Lutz MB, Kukutsch N, Ogilvie ALJ, et al. An advanced culture method for generating large qu- -antities of highly puredendritic cells from mouse bone marrow[J]. Immunol Meth, 1999, 223:77

  [6]Lutz MB,Suri RM,Niimi M,et al. Immature dendritic cells generated with low doses of GM-CSF in the absence of IL-4 are maturation resistant and prolong allograft survival in vivo [J]. Eur J Immunol, 2000,30(7):1813- 1822.

  [7] Fu F,Li Y,Qian S,et a1.Costimulatory molecule-deficient dendritic cell progenitors(MHC class Ⅱ+, CD80dim,CD86-)prolong cardiac allograft survival in nonimmunosuppressed recipients.Transplantation,1996,62(5):659-665.

  [8]王泳.來氟米特(leflunomide)的作用機制和臨床應用[J].腎臟病與透析腎移植雜志. 2004,13(2):188-191.

  [9]姜曉峰,郭大偉,崔哲銘等. 阻斷CD40-CD40配體共刺激信號誘導的移植免疫耐受對樹突狀細胞的影響[J].中國免疫學雜志,2011年第27卷:800-803.

  [10]郝念, 張明昌. 來氟米特活性代謝物A771726 抑制角膜新生血管的實驗研究[J]. 眼科研究. 2008, 26(3):191-195.

  [11] 李偉,黃象娟,李霞.來氟米特治療前后強直性脊柱炎血清IL一12及IL一15水平變化[J].實用醫學雜志,2009年12月第26卷第12期:12-13.


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